0 引言 Introduction

颞下颌关节骨关节病是以关节软骨损耗与破坏为主要特征，伴有软骨下骨组织改建和滑膜相应病变的一种退行性疾病[1-2]，临床较常见，发病机制仍不明确[3]。抑制软骨退变、促进软骨修复是目前骨关节病治疗研究的热点之一。关节软骨损伤是导致骨关节病的重要因素，然而关节软骨损伤后自我修复能力有限[4]。AUGUSTYNIAK 等[5]认为关节软骨修复主要依靠骨髓来源间充质干细胞的软骨分化，其中多种生长因子在调节这一过程中发挥重要作用，主要包括转化生长因子β、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子及血管内皮生长因子等。研究报道碱性成纤维细胞生长因子能促进软骨下骨改建、软骨细胞增殖及软骨基质形成[6]。另有研究表明胰岛素样生长因子1、碱性成纤维细胞生长因子及转化生长因子β1 等联合应用可有效促进软骨细胞增殖及基质合成[7]。

近年来研究发现富含血小板的自体血液浓缩物中含有多种与血小板相关的生长因子，如转化生长因子β、胰岛素样生长因子1、碱性成纤维细胞生长因子及血管内皮生长因子等[8]。1998 年，MARX 等[9]将第1 代自体血小板浓缩物——富血小板血浆应用于口腔医学领域，富血小板血浆通过浓缩血小板中超生理剂量的生长因子促进伤口愈合。2000 年，CHOUKROUN 等[10]通过恒速离心方法制备出富血小板纤维蛋白。富血小板纤维蛋白相比富血小板血浆具有操作简单、无需添加外源性抗凝剂而具有更好的生物安全性等优点。2006 年，有学者在此基础上通过差速不间断离心方式制备浓缩生长因子(concentrated growth factors，CGF)[11]。浓缩生长因子相比富血小板血浆具有更好的纤维结构、更多的生长因子以及CD34 阳性细胞[12]。目前浓缩生长因子在口腔种植牙槽位点保存及上颌窦提升等方面应用并取得良好效果[13-14]。有关浓缩生长因子对颞下颌关节髁突软骨损伤修复影响的研究较少。该研究通过制备穿透软骨下骨皮质的全层软骨损伤动物模型，研究浓缩生长因子对兔髁突全层软骨缺损修复的影响。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2019 年5 月至2020 年1 月在北京大学口腔医学院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 雄性日本大白兔20 只，6 月龄，体质量2.0-2.5 kg，由北京昌扬西山养殖场提供。实验方案经北京大学医学部动物伦理委员会审核批准，批准号为LA。

1.3.2 实验用主要试剂 DMEM 培养基(美国Gibco 公司)；双抗溶液(1%青霉素、链霉素，美国Gibco 公司)；兔胰岛素样生长因子1、兔转化生长因子β1、兔碱性成纤维细胞生长因子、兔血管内皮细胞生长因子ELISA 检测试剂盒(北京奇松生物科技有限公司)；戊巴比妥钠、10%乙二胺四乙酸脱钙液、苏木精-伊红染液、甲苯胺蓝染液(北京索莱宝)。

1.3.3 实验用主要设备 Medifuge 离心加速器(Medifuge MF200，Silfradent srl，意大利)；无添加真空采血管(山东成医制品有限公司，中国)；轮式切片机(Leica，日本)；体式显微镜(Olympus，日本)；酶标分析仪(Infinite F50，美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组 选取日本大耳白兔20 只，其中空白对照组2 只，取双侧髁突，其余手术制备双侧颞下颌关节髁突穿透软骨下骨皮质的全层软骨损伤，左侧为实验侧，右侧为对照侧，并按照手术损伤时间分为2 周组、6 周组、12 周组，各6 只。

1.4.2 浓缩生长因子制备 采用3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)兔耳缘静脉注射麻醉，备皮、消毒，解剖颈外静脉，用内壁含硅涂层的一次性无添加真空采血管，每只兔采集2 管共18 mL 静脉血，其中1 管用于制备实验侧浓缩生长因子凝胶，另1 管为离心配平并作为备用。抽取静脉血后迅速放入Medifuge 离心加速器中，按照设定好的程序变速离心(加速30 s，2 min 2 700 r/min，4 min 2 400 r/min，4 min 2 700 r/min，3 min 3 000 r/min，36 s 减速后停止)。离心结束后，可见离心管内分3 层：上层液相为乏血小板血浆层，下层为红细胞层，浓缩生长因子由剩余的凝胶状中间层、底部界面和红细胞层的顶部3 mm 组成。

1.4.3 浓缩生长因子中相关生长因子水平测定 于9 mL EP 管内配制3 mL DMEM 培养液，加入双抗溶液(1%青霉素及链霉素)，4 ℃保存。随机选取4 只手术组兔制备浓缩生长因子，方法同前。将浓缩生长因子加入已配好的EP 管培养基中，在37 ℃、体积分数为5%CO2潮湿环境下体外孵育21 d。分别于加入后1，3，7，14，21 d 收集析出的培养液样本，加入等量3 mL DMEM 培养液继续孵育，待样本全部收集完成后，采用ELISA 检测试剂盒测定样本中胰岛素样生长因子1、转化生长因子β1、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子水平，采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附实验，3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液显色，颜色深浅与生长因子水平呈正相关。用酶标分析仪(Infinite F50)在450 nm 波长下测定吸光度值，计算样品各生长因子水平。