0 引言 Introduction

应用组织工程修复脊髓损伤是近年来的研究热点，将种子细胞与支架材料有机结合以达到修复的目的。通过纳米技术能够优化支架的性能，对种子细胞产生积极的影响，但多数研究仍停留在体外实验阶段[1-2]。实验以胶原为原料，应用电子纺丝技术制备新型的脊髓纳米组织工程支架，选用增殖及分化能力良好的神经干细胞为优质种子细胞，二者共同构建组织工程化脊髓，探讨其体内修复SD 大鼠脊髓半横断损伤的效果，为纳米组织工程化脊髓的进一步研究及应用奠定基础。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 体外细胞学观察及随机分组动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2010 年3 月至2011 年4 月在哈尔滨医科大学附属第二医院实验中心完成。

1.3 材料

实验主要试剂：Ⅰ型胶原蛋白、胎牛血清、1，1，1，3，3，3-六氟代-2-丙醇、巢蛋白(Nestin1 ∶500)多克隆抗体、BrdU(1 ∶100)多克隆抗体、山羊抗兔IgG 二抗(TRITC 标记)及山羊抗鼠IgG 二抗(FITC 标记)、BrdU(SigmaeAldrich USA)；0.01%木瓜蛋白酶、脱氧核糖核酸酶，DMEM/F12 (Invitrogen，CA)；0.13%胰蛋白酶、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子(Chemicon，CA)；0.002%肝素(Stem cell Technology)。

实验动物：新生SD 大鼠，平均体质量10.26 g，购自哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心。成年SD 大鼠，体质量(236.) g，购自哈尔滨医科大学附第二医院实验动物中心，清洁级。实验获得哈尔滨医科大学实验动物福利和伦理管理委员会批准。

1.4 实验方法

1.4.1 纳米纤维膜的制备 原料为Ⅰ型胶原蛋白，溶剂为1，1，1，3，3，3-六氟代-2-丙醇，Ⅰ型胶原蛋白质量浓度为80 g/L，制备装置由接地电极、输液泵和高电压电源组成。溶液在7 000 V 电压作用下，以0.5 mL/h 的速率在输液泵中推注，通过平板收集器收集交错排列的纳米胶原纤维，通过鼓状收集器收集平行排列的纳米胶原纤维，收集过程中转速为3 000 r/min，收集后的纤维膜在室温并真空条件下自然干燥12 h。

1.4.2 神经干细胞的培养和鉴定 将新生SD 大鼠经乙醇浸泡消毒，取出脊髓并剥离脊膜，在完全培养液中剪碎，培养液含体积分数0.02%胎牛血清、10 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L 表皮生长因子及0.002%的肝素，基质为DMEM/F12[3]。每两三天半量换液，每 5-7 d 进行机械分离传代。以鼠抗BrdU (1 ∶100)多克隆抗体及兔抗巢蛋白(Nestin 1 ∶500)多克隆抗体作为检测一抗，以山羊抗兔 IgG (TRITC标记)及山羊抗鼠 IgG (FITC 标记)为二抗，对神经干细胞进行双标免疫组化鉴定。

1.4.3 构建组织工程化脊髓 将平行及交错排列的纳米纤维膜根据培养瓶大小裁剪成适当尺寸，进行紫外线消毒，浸泡于细胞培养液中使其充分溶胀，无菌条件下置于25 mL 培养瓶的底面。吹打传代后的神经干细胞，尽量制成单细胞悬液，取1×108L-1的神经干细胞悬液4.0-5.0 mL 加于培养瓶中。每两三天半量更换培养液，7 d 后取出纳米纤维膜进行后续实验。

1.4.4 实验分组干预与造模 将125 只成年SD 大鼠随机分为5 组，即空白对照组、平行组、交错组、平行组织工程组、交错组织工程组，每组手术操作后至少存活 20 只进行实验，术后8 周处死动物。

大鼠脊髓半横断动物模型的制作：将大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，以肋骨为标志定位T8的棘突，术区备皮，以T8棘突为中心点，取4.0-5.0 cm 的纵形皮肤切口，逐层充分暴露下胸段脊髓，以纤维器械小心地切开硬脊膜，显露脊髓中央动脉作为中线标志，以预先定位的T8棘突位置为中心，沿中线右侧切除一矩形长3-5 mm 的半横断脊髓缺损区域(图1A)。空白对照组不做进一步处理；将纳米纤维膜以PBS 充分溶胀并经紫外线照射消毒后剪成适当大小并卷成圆柱状，平行组将平行排列的纳米纤维膜植入脊髓半横断处(图1B)，交错组将交错排列的纳米纤维膜植入脊髓半横断处，平行组织工程组将平行排列纳米纤维膜构建的组织工程化脊髓植入脊髓半横断处，交错组织工程组将交错排列纳米纤维膜构建的组织工程化脊髓植入脊髓半横断处，冲洗，止血，逐层缝合。

1.5 主要观察指标

功能评估：术后第 1，2，4，6，8 周，以改良BBB 评分法评估所有动物的运动功能，于上午8 点排空动物的膀胱，观察时间为上午10 点，由3 名检测者根据改良 BBB 评分系统进行评测，每只动物观察5 min，以数码摄录机进行记录，将3 个检测者平均值作为每只动物的分值。改良BBB 评分根据大鼠双后肢及尾部的活动能力进行评测，分数与功能恢复水平呈正相关，分值范围0-21，0 分为完全瘫，21 分为正常功能[4]。