0 引言 Introduction

软骨细胞是关节软骨组织中的唯一细胞成分，其主要起到维持关节软骨组织内环境稳态的作用。软骨细胞位于软骨基质内的软骨陷窝中，在其周围有一层由胶原及蛋白聚糖等大分子构成的软骨囊，构成细胞外基质的重要成分为胶原，其中Ⅱ型胶原占90%-95%[1]。关节软骨组织损伤后自我修复能力极差的原因是其组织内无神经、血管，软骨细胞增殖能力有限[2]。软骨细胞是骨关节炎与软骨创伤后发病、关节软骨组织破坏过程中的靶细胞，软骨细胞的死亡是关节软骨退行性变的关键。因此，建立动物模型关节软骨细胞的体外培养体系对认识、研究全层软骨损伤退化有着重要意义[3]，也是研究开发抗骨关节炎药物的重要前提。骨关节炎作为最常见的老年退行性关节疾病[4-6]，以软骨磨损及关节周围的继发性骨质增生、软骨内骨化骨赘形成为主要病理特征[7-9]。目前国内外专家学者对骨关节炎的关注度越来越高，无论创伤性还是非创伤性骨关节炎的发生发展中，软骨细胞的退变都扮演着关键角色[10-11]。因此，建立科学有效的软骨细胞体外培养、鉴定研究体系是认识了解软骨细胞生物学性状，以及找寻更加有效的治疗骨关节炎等骨与软骨损伤退化疾病方法的细胞学基础[12]。基于此，此次研究对SD大鼠膝关节软骨细胞的分离、消化、提取、培养、鉴定进行较为详尽的研究，并对大鼠软骨细胞的形态学特征、不同代数软骨细胞的生物学特性进行了评价。

软骨细胞的成功提取与培养是研究其生物学特性的基础，自从1967年Manning等第1次使用胰蛋白酶及细菌胶原酶的联合消化法提取出较高纯度的软骨细胞以来[13]，为了获取纯度更高、数量更多的软骨细胞，国内外专家学者不断改进分离、提取软骨细胞的方法[14]。现如今，常用的获得软骨细胞的方法有机械-酶消化法[12]、链霉蛋白酶和胶原酶序贯消化法[15]、胰蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶序贯消化法以及单纯Ⅱ型胶原蛋白酶消化法[16-18]，在此次实验中，课题组采用一步酶消化法(单纯Ⅱ型胶原酶)分离提取SD大鼠软骨细胞。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 细胞培养实验。

1.2 时间及地点 实验于2019年1月在大连大学附属中山医院动物中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验主要试剂及仪器 双抗、胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液(Biowest公司，法国)；DMEM培养基、胎牛血清(Hyclon公司，美国)；CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术研究所，中国)；水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司，中国)；大鼠Ⅱ型胶原免疫荧光抗体( Abcam公司，英国)；甲苯胺蓝染色剂(索莱宝，中国)；显微外科手术器械(新华手术器械有限公司，中国)；酶标系统多功能仪(百基生物，中国)；BH-2型光学显微镜、倒置相差显微镜、荧光显微镜(Olympus公司，日本)。

1.3.2 实验动物 选取清洁级SD大鼠1只，由大连医科大学、实验动物机构提供，许可证号：SYXK(辽)2018-0005，饲养在SPF条件下，室内温度恒定在20 ℃、湿度为48%，使用标准啮齿类动物饲料喂养。动物饲养及处置均在大连大学附属中山医院动物中心实验室进行。

1.4 实验方法 该方法在近一年的相关实验中多次使用，为其他系列实验提供了大量可靠的软骨细胞，文章中使用1只实验动物为一次软骨提取的供体。此方法在实验反复操作中表现良好，具有优秀的可重复性。

1.4.1 鼠膝关节软骨组织提取 大鼠腹腔注射体积分数10%水合氯醛过量麻醉致死，术区精细备皮、反复消毒，取双下肢股骨外侧正中入路，充分暴露、游离双侧股骨，彻底清除所附着肌肉、韧带、关节囊等软组织，剥离出双股骨的两端(股骨头及股骨髁)软骨组织，弯头镊子取出组织块放于培养皿中，PBS反复漂洗，洗去杂质、血液及骨组织残渣；将漂洗后的软骨组织切碎成1 mm×1 mm小块，再次行PBS冲洗。

1.4.2 软骨细胞的分离、培养与传代 将适宜大小组织块转移至50 mL离心管中，再加入5 mL 0.02%Ⅱ型胶原酶、5 mL DMEM-F12培养基、500 μL双抗，将其倾斜放置于 37 ℃，体积分数为5%的CO2培养箱培养过夜；吹打均匀，经150目筛网过滤，收集细胞，1 000 r/min离心8 min，吸去上清，加入2.5 mL含体积分数10%胎牛血清的DMEM-F12培养基，吹打均匀后接种于细胞培养瓶，放置于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱培养，倒置显微镜观察细胞形态及生长情况。原代细胞培养7 d后开始换液，自此之后每3 d换液1次，培养到9 d后细胞攀爬至培养皿底面积90%左右时进行传代，细胞数量按1∶2比例传代，待细胞再次铺满培养皿底部7 d左右再传1代，传代操作时先行PBS清洗，胰蛋白酶消化重悬，调整细胞浓度为6×109L-1，接种于新培养瓶。