0 引言 Introduction

1 材料和方法 Materials and methods

随着人们生活水平的不断提高，生活习惯和饮食结构也发生变化，痛风在中国的发病率明显升高，且呈年轻化趋势，严重危害患者的身体健康。痛风是嘌呤物质代谢紊乱、血尿酸浓度持续增高导致尿酸盐结晶沉积软组织所致的一组代谢性疾病，其临床表现为血尿酸水平升高及由此引起的痛风性急性关节炎反复发作[1]、痛风石沉积[2-3]、痛风石性慢性关节炎和关节畸形等[4-5]。急性痛风性关节炎是痛风最常见的首发症状，如不积极治疗，易导致机体严重性的疾病。目前对痛风常规治疗的西药有秋水仙碱、非类固醇类抗炎药、糖皮质激素、非布索坦、别嘌呤醇或苯溴马龙等，临床发现它们的毒副作用较大[6-9]，从而在临床上应用受限。近年来，单味中药或中药提取物、复方中药治疗急性痛风性关节炎方面的研究取得了很大成就，例如苗药透骨香、虎杖乙醇提取物、绞股蓝提取物、槲皮素、加味四妙丸、川胡抗痛风合剂等[10-13]，均可不同程度减轻关节肿胀度，对炎性疼痛发挥镇痛作用，降低血尿酸和黄嘌呤氧化酶水平，改善关节滑膜组织病理改变。黑骨藤是贵州苗族地区民间广泛用于风湿、类风湿、痛风等疾病的民族药，苗药名为蛙莽塞(贵州黔南州)，俗称黑骨头、滇杠柳，为萝藦科植物黑龙骨的根或全草，味苦、辛，性凉，小毒，具有舒筋活血、祛风除湿、消炎解毒、镇痛等功效，研究表明黑骨藤有抗炎镇痛、抗肿瘤、抗氧化损伤、抗类风湿性关节炎及抗急性痛风性关节炎等作用[14-17]。课题组进一步以镇痛和抗炎作为主要药效学指标对黑骨藤有效部位进行筛选，结果发现黑骨藤水提物和石油醚提取物的镇痛、抗炎作用均不如醇提物，最后确定黑骨藤醇提取物为黑骨藤有效部位[18]。该实验拟用苗药黑骨藤醇提取物不同剂量(高、中、低剂量治疗组分别为100，50，25 mg/kg)灌胃尿酸钠诱导的急性痛风性关节炎模型，来研究黑骨藤醇提取物对急性痛风性关节炎的作用及机制，为挖掘苗药黑骨藤的药用价值提供科学的理论基础和实验依据。

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2019 年3 至11 月在黔南民族医学高等专科学校完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 12 周龄SPF 级雄性SD 大鼠60 只，体质量180-200 g，由黔南民族医学高等专科学校实验动物中心提供。实验过程中对动物的饲养及操作处置符合相关动物伦理学标准。

1.3.2 实验药材及试剂、仪器 黑骨藤药材购于贵阳市万东桥中药材市场，由贵阳医学院生药室鉴定并进行提取；秋水仙碱片为云南西双版纳版纳药业有限责任公司生产，使用前用蒸馏水稀释成0.003 g/L；尿酸钠结晶购自美国Sigma 公司；吐温80 购自天津复精细化工研究所；白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、白细胞介素17 试剂盒购自南京建成生物工程研究所；BCA 蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所；免抗鼠NF-κB p65、ERK1、ERK2、JNK 和p-JNK 抗体购于英国Abcam 公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 黑骨藤醇提取物的制备 取黑骨藤药材，粉碎，过60目筛，加入8 倍质量的体积分数80%乙醇，在70 ℃水浴中回流提取3 次，每次2 h，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.5 的流浸膏，再加入1 倍体积量的水，冷藏并静置24 h，取上清液，回收乙醇，浓缩，干燥，即得黑骨藤醇提取物。

1.4.2 实验动物分组 SD 大鼠适应性饲养3 d 后，将60 只健康SD 大鼠随机分为6 组，分别为空白对照组、模型对照组、秋水仙碱治疗组、黑骨藤醇提取物高、中、低剂量治疗组，每组10 只。实验大鼠均分笼饲养，自由摄食饮水，自然光照并定期清洁、消毒。

1.4.3 急性痛风性关节炎造模[17]除空白对照组外，其他各组均用水合氯醛3 mL/kg 腹腔注射麻醉，仰卧位固定，麻醉15 min 后用6 号注射针于右侧踝关节后侧30°-40°方向插入至跟腱内侧，感觉有落空感后，将0.2 mL 尿酸钠溶液(取250 mg 尿酸钠结晶，加入45 mL 生理盐水注射液，再加5 mL 吐温80，加热搅拌，配成50 g/L 的尿酸钠溶液)注入关节腔内，以关节囊对侧鼓起为注入标准，诱导急性痛风性关节炎。空白对照组采用6 号注射针于右侧踝关节后侧30°-40°方向插入至跟腱内侧，将0.2 mL 生理盐水注入关节腔内。

组织工程实验动物造模过程的相关问题选择动物的基本资料 12 周龄SPF 级雄性SD 大鼠60 只，体质量180-200 g，由黔南民族医学高等专科学校实验动物中心提供造模技术描述 用6 号注射针于右侧踝关节后侧30°-40°方向插入至跟腱内侧，感觉有落空感后，将0.2 mL 尿酸钠溶液注入关节腔内，诱导急性痛风性关节炎动物数量及分组方法 SD 大鼠适应性饲养3 d 后，将60 只健康SD 大鼠随机分为6组，分别为空白对照组、模型对照组、秋水仙碱治疗组、黑骨藤醇提取物高、中、低剂量治疗组，每组10 只造模成功评价指标 以关节囊对侧鼓起为注入成功标准，诱导急性痛风性关节炎造模后取材及观察指标 造模前1 h 及造模后1-7 d 观察关节肿胀度；在造模后第7 天取血清和滑膜组织，ELISA 法检测白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、白细胞介素17 水平，Western blot 检测滑膜组织中NF-κB、ERK1/2 和JNK 蛋白表达伦理委员会批准 实验方案经黔南民族医学高等专科学校医学伦理委员会批准