0 引言 Introduction

膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是最常见的骨骼肌退行性疾病之一，伴有持续疼痛和功能障碍，滑膜炎症、关节软骨的进行性退变是其主要的病理特征[1-4]。有研究指出KOA 是导致下肢残疾的十大病因之一[3]。尽管目前KOA 的发病机制尚不清楚，但炎症一直被认为是KOA 病程中的重要环节[3，5-7]。已有研究提示软骨损伤可引起滑膜炎症，软骨细胞介导的炎症反应在骨关节炎的发生发展中起关键作用[7]。因此，有效抑制软骨细胞炎症可能在延缓甚至逆转骨关节炎的进展中发挥作用。

通络止痛凝胶是在现代药物提取技术的基础上将通络止痛方制备成凝胶制剂，直接用于患处，方便患者使用。既往研究表明通络止痛方可以有效抑制滑膜炎症、改善患者症状[8-10]，然而通络止痛凝胶对软骨炎症及退变改善情况以及何种程度的KOA 更适用于通络止痛凝胶治疗，目前仍不清楚。因此该研究拟通过动物实验论证通络止痛凝胶对于KOA软骨炎症及退变的影响以及初步探讨何种程度的KOA 更适用于通络止痛凝胶治疗。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2019 年5 至12 月在中国中医科学院中药研究所完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物与分组 所有家兔均饲养于中国中医科学院医学动物实验中心，该研究严格按照《实验动物护理和使用指南》福利伦理执行，并得到中国中医科学院动物护理和使用委员会批准。选取雄性6 月龄家兔56 只，体质量(2.) kg，均由北京科宇动物养殖中心提供，合格证号：SCXK(京)2018-0010，适应性喂养1 周后使用随机数字表法将家兔随机等分为8 组，每组7 只，即空白对照组、假手术组、轻度KOA 模型组、中度KOA 模型组、重度KOA 模型组、通络止痛凝胶干预轻度KOA 组、通络止痛凝胶干预中度KOA组、通络止痛凝胶干预重度KOA 组，所有家兔均用同样饲养条件喂养。

1.3.2 实验主要药物、试剂 通络止痛凝胶按规定配方比例及流程(专利号：2.8)制作而成，主要成分为卡波姆基质940(上海源叶生物科技有限公司)、浓煎中药液(桂枝、白芍、桃仁、制草乌、牛膝等)、桂皮醛脂质体混悬液(由桂皮醛、卵磷脂、胆固醇等按配方比例制成)和乳香、没药细粉。水合氯醛(北京拜尔迪生物科技有限公司)；BCA 蛋白浓度测定试剂盒(美国Thermo Scientific 公司)；qPCR 所需试剂(南京诺唯赞生物科技有限公司)；兔白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13 以及解聚蛋白样金属蛋白酶5 一抗(美国CST 公司)；β-Actin、二抗及荧光显影液(美国Proteintech 公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 家兔造模与干预 空白对照组不予以任何处理；假手术组在切开关节囊后立即予以缝合，以排除手术影响，随后不予以处理；其余各组均予以改良Hulth 法[11]进行造模，切断右膝内侧副韧带、前交叉韧带及切除内侧半月板，确定关节不稳后逐层缝合并予以连续3 d 肌肉注射青霉素8×105U防止感染，术后1 周所有动物每日驱赶30 min。根据文献报道，以造模后4，8，16 周为轻、中、重度KOA 模型时间节点[12]；空白对照组和假手术组在11 周时处死，轻、中、重度KOA 模型组分别于造模后4，8，16 周时处死，通络止痛凝胶干预轻、中、重度KOA 组分别在造模4，8，16 周予以通络止痛凝胶外敷治疗3 周，每周3 次(周一、周三及周六)，最后一次给药后2 d 处死。通络止痛凝胶外敷治疗量根据人与动物体表面积换算公式计算得出，每次约为1 mL 凝胶。

组织工程实验动物造模过程的相关问题造模目的 制备不同程度的膝关节骨性关节炎家兔模型选择动物的基本资料雄性家兔56 只，体质量(2.) kg，随机分为8 组，空白对照组、假手术组，轻、中、重度膝关节骨性关节炎模型组，通络止痛凝胶干预轻、中、重度膝关节骨性关节炎组，每组7 只模型与所研究疾病的关系手术诱发性动物模型造模技术描述 切断右膝内侧副韧带、前交叉韧带及切除内侧半月板造模成功评价指标造模后关节不稳，苏木精-伊红染色显示软骨退变观察指标 测量右膝关节直径、苏木精-伊红染色观察软骨形态学变化，RT-qPCR 和Western blot 检测软骨组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13 及解聚蛋白样金属蛋白酶5 的mRNA 水平伦理委员会批准实验方案经中国中医科学院动物护理和使用伦理委员会批准，批准号为

1.4.2 样本收集与保存 用10%水合氯醛按2 mL/kg 的量对家兔进行耳缘静脉注射麻醉，测量右膝关节直径变化并记录，然后逐层暴露膝关节，取出膝关节股骨末端，1 份置于体积分数为10%甲醛溶液中常温保存进行固定，随后进行包埋、切片及苏木精-伊红染色，观察软骨组织损伤情况；1 份用于RT-qPCR、western blot 检测软骨组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶13 及解聚蛋白样金属蛋白酶5 的表达。