0 引言 Introduction

骨质疏松是指由于骨量减少、骨微结构退变导致骨骼强度下降、脆性增加以及易于发生骨折的一种全身性、代谢性疾病。随着社会老龄化加剧，骨质疏松的发病率正在逐年攀升，其相关并发症如骨折等严重威胁人们的生活质量[1]。目前，临床上用于治疗骨质疏松的药物大多以抑制破骨细胞的活性以及骨吸收为主[2]，然而长期的抑制骨吸收将使破骨细胞处于“无应答”的状态[3]，降低药物的疗效，因此提高成骨细胞的活性以及促进骨形成是更加理想的方法[4]。近年来，中药及其活性成分促进骨形成的研究报道日益增多，其中淫羊藿苷出现的频率最高[5]，2017 年版《原发性骨质疏松症诊疗指南》中亦明确指出[1]，在骨质疏松的中医药治疗中，淫羊藿苷是疗效确切的中药活性成分。研究指出淫羊藿苷能够激活骨重塑、促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化、抑制骨髓间充质干细胞的成脂分化，促进成骨细胞的成骨活性[6-7]，但其抗骨质疏松的具体机制至今尚未完全明确。

自噬是指真核细胞通过溶酶体途径对细胞质内的非功能性蛋白和细胞器进行降解以维持存活的过程，自噬在维持骨代谢平衡方面发挥着重要作用[8]，其水平的改变是骨质疏松发病的重要原因[9-10]。研究指出自噬对成骨细胞的分化及矿化具有积极的意义[11]，但淫羊藿苷对成骨细胞自噬存在怎样的影响目前尚缺乏研究报道，因此在此次研究中，课题组通过体内、体外实验探讨淫羊藿苷是否能通过影响自噬而防治骨质疏松。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 细胞及动物对比观察实验，分为3 个部分：①淫羊藿苷最佳浓度的筛选；②淫羊藿苷通过自噬促进成骨细胞分化；③动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2019 年7 月至2020 年3 月在广州中医药大学岭南医学研究中心骨伤科重点实验室以及广州中医药大学实验动物中心完成。

1.3 材料

1.3.1 细胞株 小鼠前体成骨细胞株MC3T3-E1 购自武汉Procell，货号：CL-0378。

1.3.2 实验动物 6 月龄SPF 级雌性SD 大鼠24 只，体质量200-300 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，实验动物质量合格证明编号：NO.44，实验动物许可证号编号：SCXK(粤)2018-0034，实验单位使用许可证编号：SYXK(粤)2018-0001。实验方案经广州中医药大学实验动物中心动物实验伦理委员会批准，批准号：2。

1.3.3 药物 淫羊藿苷购于MACKLIN，货号：I，纯度≥98%，20 mg/支。

1.3.4 主要实验仪器 细胞超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；移液器、冷冻离心机(Eppendorf，德国)；倒置相差显微镜(Leica，德国)；全自动酶标仪、细胞培养箱(Thermo Fisher，美国)；实时荧光定量PCR 仪(Applied Biosystems Inc，美国)；多功能激光扫描成像系统(Amersham，英国)；凝胶成像系统(上海天能科技，中国)；Micro-CT(Encho-MRI/LCT-200，美国)。

1.3.5 主要试剂 α-MEM 培养基(Hyclone，美国)；磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)、胎牛血清、青链霉素、0.25%胰蛋白酶(Gibco，美国)；β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、地塞米松(Sigma，美国)；碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国)；ALP 染色试剂盒(碧云天生物技术有限公司，中国)；茜素红粉剂(阿拉丁试剂有限公司，上海)；细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK8)、ANNEXIN V-FITC/PI 凋亡试剂盒(索莱宝科技有限公司，北京)；单丹磺酰戊二胺(Monodansylcadaverin，MDC)染色试剂盒(雷根生物技术有限公司，北京)；3-甲基腺嘌呤(3-methyl adenine，3-MA，上海源叶生物，中国)；戊酸雌二醇(拜尔医药保健有限公司，中国)；细胞RNA 快速提取试剂盒、两步法荧光定量反转录PCR 试剂盒(Takara，日本)。

1.4 实验方法

1.4.1 淫羊藿苷最佳浓度的筛选 消化第3 代MC3T3-E1 细胞，将细胞分为对照组和淫羊藿苷不同浓度组(10-3，10-4，10-5，10-6mmol/L)，进行以下测试：

(1)CCK8 检测细胞增殖：消化第3 代细胞以3×103个/孔的密度接种于96 孔板，细胞分组同上，每组设置6 个复孔；接种24 h 待细胞贴壁后，弃去旧培养基，加入含淫羊藿苷的培养基，干预24，48，72 h 后弃去培养基，每孔加入100 μL混匀好的CCK8 溶液(将CCK8 溶液与培养基按照1 ∶9 的比例混匀)，避光孵育2 h后用酶标仪在450 nm处测定吸光度(A)值，并计算细胞活力。

(2)ALP 染色：消化第3 代细胞，以3×104个/孔的密度接种于24 孔板，细胞分组同上，每组4 个复孔，在培养箱中培养24 h；24 h 弃去培养基，加入含淫羊藿苷或不含淫羊藿苷的新鲜成骨诱导培养基(10 mmol/L 的β-甘油磷酸钠、50 μmol/L 抗坏血酸、10-8mol/L 地塞米松)，每2 d 换液1 次；培养7 d 后按试剂盒步骤进行染色，扫描并显微镜拍照。