背景:常用的获得软骨细胞的方法有机械-酶消化法、链霉蛋白酶和胶原酶序贯消化法、胰蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶序贯消化法以及单纯Ⅱ型胶原蛋白酶消化法。目的:探讨SD大鼠膝关节软骨细胞Ⅱ型胶原酶体外分离、提取、鉴定方法,观察原代至第3代软骨细胞的形态学特点。方法:课题组采用一步酶消化法(Ⅱ型胶原酶)体外分离、提取、培养SD大鼠膝关节软骨细胞并进行传代培养,进而构建其体外培养体系。使用细胞增殖实验、倒置相差显微镜观察细胞组织学形态;甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原与蛋白聚糖免疫荧光染色等方法进行细胞性状鉴定。实验经大连大学附属中山医院伦理委员会批准。结果与结论:①镜下观察与细胞增殖实验均显示第2,3代细胞形态、增殖能力最佳,后逐渐退化;②甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原与蛋白聚糖免疫荧光染色等组织学检测显示,第3代体外培养软骨细胞状态功能良好;③结果表明,一步酶消化法(Ⅱ型胶原酶)能够成功地从SD大鼠膝关节标本中分离出软骨细胞并且可以进行传代培养;体外培养3代后软骨细胞去分化特性逐渐增强,第3代体外培养软骨细胞性状良好,可用于实验研究。